血(xiě)液凍幹機(jī)
：血小板凍(dòng)幹(gān)再水化的條(tiáo)件(jiàn)及(jí)其(qí)凝血(xiě)功能變化(huà)

　　血(xiě)小(xiǎo)板(bǎn)(plaet)是由骨(gǔ)髓巨(jù)核(hé)細胞(bāo)產生並釋放(fàng)於血(xiě)液(yè)循環(huán)中的zui小細胞,在止血和(hé)凝(níng)血過程(chéng)中發揮著重要(yào)的作(zuò)用。 由於(yú)血(xiě)小板(bǎn)保(bǎo)質期較(jiào)短(duǎn)，臨(lín)床(chuáng)輸注(zhù)需(xū)求量大(dà)， 加之(zhī)臨床輸注需求時間的(dí)不確定性(xìng)， 造成了血小(xiǎo)板過期(qī)浪(làng)費和臨(lín)床供(gōng)不(bù)應求(qiú)的兩(liǎng)難(nán)尷尬局麵。

目前國內血小板主要保存方(fāng)式是22℃振(zhèn)蕩保存(cún)，有效期為 5d。 此(cǐ)外血小板還(huán)可(kě)深低(dī)溫冰凍保存， 但(dàn)這種(zhǒng)方法的(dí)保存效(xiào)果(guǒ)和臨床(chuáng)療效不確切。 冷凍幹(gān)燥技(jì)術已(yǐ)廣泛(fàn)應(yīng)用於各種(zhǒng)生(shēng)物(wù)材料(liào)的(dí)保(bǎo)存(cún)， 凍(dòng)幹製品(pǐn)具有常(cháng)溫(wēn)下保存(cún)， 性(xìng)能穩(wěn)定，便(biàn)於(yú)運輸的特(tè)點。 本研究以過期血(xiě)小板為(wéi)原料(liào)，探(tàn)索血(xiě)小板凍幹(gān)再(zài)水(shuǐ)化(huà)的(dí)條(tiáo)件(jiàn)，檢(jiǎn)測(cè)其(qí)凍幹再(zài)水(shuǐ)化後凝(níng)血功(gōng)能(néng)的變(biàn)化， 為過(guò)期血小(xiǎo)板(bǎn)再利用及新(xīn)鮮(xiān)血(xiě)小(xiǎo)板冰凍(dòng)或低溫保存研究(jiū)提(tí)供(gōng)了依(yī)據。

　　1， 材料(liào)與方法(fǎ)

　　1.1 實驗(yàn)材(cái)料(liào)

　　1.1.1 血小板來源(yuán) 實驗(yàn)組選擇(zé)體檢合(hé)格(gé)， 一周(zhōu)內未服用(yòng)阿司匹(pǐ)林等抗血小(xiǎo)板(bǎn)藥物的自(zì)願獻(xiàn)血者(zhě)，用血(xiě)細胞(bāo)分(fēn)離(lí)機單(dān)采(cǎi)富(fù)含(hán)血小板血(xiě)漿，22℃振蕩保存(cún) 5d 過期；對照組選(xuǎn)擇新(xīn)鮮(xiān)機采血小板(bǎn)。

　　1.1.2 主(zhǔ)要試(shì)劑(jì)和溶液(yè) 海(hǎi)藻糖 (CH22O11·2H2O，北(běi)京經(jīng)科(kē)宏達生(shēng)物技(jì)術(shù)有(yǒu)限(xiàn)公司(sī))； 牛血清(qīng)白(bái)蛋(dàn)白(BSA，上海(hǎi)生工生物工(gōng)程(chéng)有限公司)；磷酸鹽緩衝液(PBS)； 血小板聚集(jí)誘導劑(jì)二磷酸腺(xiàn)苷(gān)(ADP，Sigma公司(sī))；凝(níng)血酶(Sigma 公司(sī))；膠(jiāo)原(Sigma 公(gōng)司)；瑞斯(sī)托(tuō)黴(méi)素(Sigma 公(gōng)司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公(gōng)司(sī) )； 海藻糖加(jiā)載緩(huǎn)衝(chōng)液 ( 含50mmol/L 海(hǎi)藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為(wéi) 6.8)；凍幹保護劑(jì)(含(hán) 20%海(hǎi)藻糖(táng) ，1% 牛血清白(bái)蛋(dàn)白 ，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；復水溶(róng)液(yè)為 PBS 緩衝液和(hé)蒸(zhēng)餾(liù)水以(yǐ) 3:1 比例混合製成。 以(yǐ)上試劑(jì)和溶液均在有效(xiào)期內。

　　1.2 主(zhǔ)要儀器(qì)

凍(dòng)幹(gān)機(jī)

，恒(héng)溫振蕩水浴，流式(shì)細胞(bāo)儀(yí)，血球計(jì)數儀，血小(xiǎo)板(bǎn)聚(jù)集(jí)儀(yí)

　　1.3 實驗(yàn)方法(fǎ)

　　1.3.1 血(xiě)小(xiǎo)板的(dí)凍幹(gān)保存 血小(xiǎo)板濃(nóng)縮(suō)液(yè)離(lí)心洗滌(dí)後重(zhòng)懸於(yú)海(hǎi)藻糖加(jiā)載(zǎi)緩(huǎn)衝(chōng)液中， 將(jiāng)上述懸浮液轉移(yí)進(jìn)入離心管中(zhōng)，並用聚四(sì)氟(fú)乙稀生料(liào)帶(dài)密封(fēng)，於(yú)37℃水(shuǐ)浴(yù)中振蕩(dàng)孵(fū)化(huà) 4h。 將孵化(huà)後的(dí)血小板懸(xuán)浮液(yè) 800g 離(lí)心 3min。 去(qù)除上層(céng)孵(fū)化液(yè)，得到(dào)沉澱的(dí)血(xiě)小板塊，加入(rù)凍幹保護液(yè)打散重懸(xuán)，使(shǐ)用(yòng)血(xiě)球計數(shù)儀進行計數， 調(tiáo)節(jié)血小板(bǎn)在(zài)凍幹保(bǎo)護液(yè)中(zhōng)的濃度(dù)為(wéi) 1×109個/ml。 將製(zhì)備(bèi)好的血小板凍幹懸浮(fú)液(yè)裝入特製凍幹(gān)血(xiě)盒(hé)中，密封充(chōng)注口(kǒu)。 將(jiāng)血(xiě)小板(bǎn)凍幹懸(xuán)液(yè)先以 20℃/min 的(dí)速(sù)率凍結(jié)至-40℃， 預凍 2h後，再以 1.5℃/min 對擱板升(shēng)溫至-30℃，退(tuì)火(huǒ) 0.5h，然(rán)後(hòu)進入(rù)一次幹燥，-38℃維持一次幹燥(zào)條件(jiàn) 20h，zui後以 0.2℃/min 的(dí)加熱速(sù)率(shuài)使(shǐ)隔板溫度升高(gāo)至(zhì)20℃，維持(chí)二次幹燥(zào)條(tiáo)件 10h 直(zhí)至凍幹結束。 凍幹的血小板(bǎn)密(mì)封(fēng)保存(cún)在室溫(wēn)。

　　1.3.2 凍(dòng)幹(gān)血(xiě)小(xiǎo)板的水化 將(jiāng) PBS 緩衝(chōng)液和(hé)蒸餾(liù)水(shuǐ)以(yǐ) 3:1 的(dí)比(bǐ)例混合製成血小板(bǎn)凍(dòng)幹復(fù)水液(yè)，將1ml 復(fù)水液在室溫(wēn)下直(zhí)接(jiē)加入凍(dòng)幹樣品瓶(píng)中，輕(qīng)輕震(zhèn)蕩(dàng)直(zhí)到樣品(pǐn)*溶解(jiě)於(yú)復水溶(róng)液(yè)中(zhōng)。

　　1.3.3 檢(jiǎn)測血小板回收率 用血球(qiú)計數儀(yí)分(fēn)別對凍幹(gān)前和凍幹再水(shuǐ)化(huà)後的血(xiě)小板計數， 計算(suàn)凍幹(gān)再水化血(xiě)小板回收(shōu)率(shuài)。凍幹(gān)再(zài)水化血(xiě)小板(bǎn)回收(shōu)率(shuài)(%)=凍幹(gān)再水(shuǐ)化後(hòu)血(xiě)小板(bǎn)計數/凍幹(gān)前(qián)血小(xiǎo)板(bǎn)計(jì)數(shù)×100%。

　　1.3.4 檢測血(xiě)小板穩(wěn)定(dìng)性 凍(dòng)幹(gān)再水(shuǐ)化血小(xiǎo)板分(fēn)別在室溫放置(zhì) 0h，2h，4h，6h，8h 後(hòu)，用血(xiě)球(qiú)計數儀測(cè)定(dìng)血小板(bǎn)回(huí)收率(shuài)。

　　1.3.5 血小板(bǎn)形態及(jí)超(chāo)微結(jié)構觀(guān)察(chá) 用掃(sǎo)描電鏡觀(guān)察血小板的形(xíng)態；分別(bié)以戊二醛(quán)固定，脫(tuō)水，環氧(yǎng)樹脂包埋(mái)後(hòu)製(zhì)作超薄(báo)切片(piàn)， 用(yòng)透(tòu)射電鏡觀(guān)察血(xiě)小板(bǎn)超(chāo)微結構變(biàn)化。

　　1.3.6 血(xiě)小板(bǎn)聚(jù)集反應檢(jiǎn)測 將(jiāng)凍幹(gān)血小板復水(shuǐ)後(hòu)轉(zhuǎn)入離心管(guǎn)中進(jìn)行洗滌以(yǐ)去(qù)除細(xì)胞外(wài)保護(hù)劑，再用新(xīn)鮮(xiān)冰(bīng)凍血漿重(zhòng)懸(xuán)血小板(bǎn)， 調(tiáo)整(zhěng)血小板濃(nóng)度為(wéi)(0.2~0.3)×1012/L。 用(yòng) APACT-2 型血小(xiǎo)板聚集儀檢(jiǎn)測凍(dòng)幹(gān)再水化(huà)後血小(xiǎo)板(bǎn)對(duì)四(sì)種(zhǒng)同濃度誘(yòu)導(dǎo)劑—凝(níng)血酶，膠(jiāo)原，ADP 和瑞斯托(tuō)黴素的聚(jù)集(jí)反應(yīng)。

　　1.3.7 血(xiě)小板表(biǎo)麵(miàn)糖(táng)蛋(dàn)白(bái)檢測(cè) 用三(sān)色(sè)流(liú)式細胞儀(yí)分(fēn)別檢測凍幹(gān)再水化血(xiě)小板表麵(miàn)激活指標 CD62p和 PAC-1 的(dí)表達，經凝血酶激活(huó)後(hòu)測定 CD62p 和PAC-1 的再(zài)表達。 再表達(dá)率=凝血酶處(chǔ)理後表達率-血(xiě)小板表(biǎo)達(dá)率(shuài)1.3.8 統計分(fēn)析(xī) 數據以均(jūn)數±標準差(chà)(x±s)表示，采用(yòng) SPSS16.0 統計(jì)軟(ruǎn)件進(jìn)行(háng)數據分析處理， 組間差異比較(jiào)用(yòng) t 檢驗(yàn)，P<0.05 為(wéi)差(chà)異(yì)有統(tǒng)計學意(yì)義。

　　2， 結(jié)果

　　2.1 血小板回收率(shuài)及穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)組(zǔ)和(hé)對(duì)照組(zǔ)間血(xiě)小板(bǎn)計數有(yǒu)統計(jì)學意(yì)義(P<0.05)，凍(dòng)幹(gān)再水(shuǐ)化血小板回收率(shuài)為 49.36%，見(jiàn)表 1；凍(dòng)幹(gān)再水化(huà)血小(xiǎo)板(bǎn)穩(wěn)定性隨(suí)血小板放置時間的(dí)延長， 血小板回(huí)收率(shuài)逐漸(jiàn)下(xià)降，見圖 1。

　　2.2 血小板形態及超微(wēi)結(jié)構(gòu) 掃描電鏡顯示(shì)新(xīn)鮮血小(xiǎo)板(bǎn)透光性較強，形態呈圓(yuán)形或橢圓(yuán)形，邊(biān)緣光滑， 而凍(dòng)幹再(zài)水化血小板透(tòu)光性較弱， 血(xiě)小(xiǎo)板變(biàn)形，見(jiàn)圖 2A 和(hé) B。 透射(shè)電鏡顯示(shì)新(xīn)鮮血小板著(zhuó)色較深(shēn)，α 顆(kē)粒，致密顆(kē)粒(lì)，過氧化酶(méi)顆(kē)粒(lì)等分散，清晰，而(ér)凍幹(gān)再水化血小板(bǎn)著(zhuó)色(sè)較(jiào)淺，致密(mì)顆粒及(jí) α顆粒(lì)不夠清晰(xī)，且數目少(shǎo)於對照組，見(jiàn)圖(tú) 2C 和 D。

　　2.3 聚(jù)集(jí)反(fǎn)應 實驗組和(hé)對(duì)照(zhào)組間血小板同濃(nóng)度(dù)誘導劑(jì)下的zui大聚集率均有(yǒu)統(tǒng)計(jì)學意義 (P<0.05)，實(shí)驗組(zǔ)血小板對凝(níng)血酶(méi)，膠(jiāo)原(yuán)，ADP 和(hé)瑞(ruì)斯(sī)托黴(méi)素的聚(jù)集功(gōng)能(néng)較對照(zhào)組均出現下(xià)降，見表(biǎo) 2。

　　2.4 血小板(bǎn)表麵糖蛋(dàn)白 實驗(yàn)組 CD62p 表達(dá)率(shuài)和再表達(dá)率分(fēn)別(bié)為(wéi) 50.25%，94.27%，均(jūn)顯(xiǎn)著高於(yú)對(duì)照組(zǔ)的(dí) 8.12%，78.43%(P<0.05)；凝血酶(méi)作(zuò)用後(hòu) CD62p再表(biǎo)達率為 44.02%，顯著(zhù)低於(yú)對照組(zǔ) 70.31% (P<0.05)。 pac-1="" p="">0.05)，PAC-1 再表達率為42.75%，顯(xiǎn)著低(dī)於對照(zhào)組(zǔ) 67.29%(P<0.05)，凝血(xiě)酶作用後 PAC-1 再(zài)表達(dá)率為(wéi) 38.90%，顯(xiǎn)著低(dī)於對照組 65.28%(P<0.05)，見表 3。

　　3，討論(lùn)

　　血(xiě)小板(bǎn)數(shù)目(mù)減少或功(gōng)能(néng)不(bù)全(quán)所致出血性疾(jí)患的預防和(hé)治療，臨床(chuáng)多采(cǎi)用(yòng)輸注血小板製劑。 血小板保(bǎo)存(cún)技(jì)術的缺(quē)陷是血(xiě)小(xiǎo)板過期浪費(fèi)和臨床供(gōng)不應求(qiú)的兩難處境的(dí)主(zhǔ)要原(yuán)因，因此，研究出(chū)一(yī)種能長期，，安(ān)全和方便的(dí)血小(xiǎo)板(bǎn)保(bǎo)存方法(fǎ)一直(zhí)是國內外(wài)輸(shū)血(xiě)工作者關注(zhù)的熱點(diǎn)和難(nán)題。

　　將過(guò)期(qī)的(dí)血(xiě)小板(bǎn)再利用及血小板的凍幹(gān)保存(cún)有著廣闊(kuò)的應用前(qián)景。 本(běn)研(yán)究(jiū)顯示凍幹再(zài)水化(huà)的過期(qī)血小(xiǎo)板回收率及(jí)穩(wěn)定性(xìng)較差， 說明凍(dòng)幹和再(zài)水化過程(chéng)對血(xiě)小板功(gōng)能造成一(yī)定影(yǐng)響， 應進一(yī)步改進(jìn)凍幹(gān)保存時(shí)擱板(bǎn)溫(wēn)度，復(fù)水液組分(fēn)和(hé)比(bǐ)例，以及(jí)增(zēng)加預復水(shuǐ)步驟。 透(tòu)射電(diàn)鏡下新鮮(xiān)血小板(bǎn)著色(sè)相對(duì)較(jiào)深， 可(kě)能為新鮮血小板(bǎn)生物活性較(jiào)高或膜通(tōng)透性相(xiāng)對(duì)較(jiào)高，因而有較(jiào)強吸附染料的能(néng)力(lì)。

　　CD62p 和 PAC-1 分別(bié)為(wéi)血小板(bǎn)表麵活化晚期標誌物和活化(huà)早期的(dí)標(biāo)誌(zhì)物， 結果(guǒ)顯(xiǎn)示過期血小板(bǎn)對(duì)凝血(xiě)酶，ADP， 膠原(yuán)及瑞(ruì)斯托黴素的zui大聚集率(shuài)明顯(xiǎn)小於新(xīn)鮮(xiān)血(xiě)小板，凝血酶作用(yòng)後(hòu) CD62p 和 PAC-1 的再(zài)表達率低(dī)於新鮮血小板(bǎn)，說明(míng)過(guò)期以及凍幹(gān)和(hé)再水(shuǐ)化過程(chéng)對(duì)血(xiě)小(xiǎo)板(bǎn)凝血(xiě)功(gōng)能(néng)有(yǒu)影響(xiǎng)， 但(dàn)凍(dòng)幹再(zài)水化(huà)的過(guò)期血(xiě)小(xiǎo)板(bǎn)仍(réng)具(jù)有一(yī)定的存活(huó)能力(lì)和功(gōng)能活(huó)性， 因此選(xuǎn)擇血小板(bǎn)進行冷凍幹燥(zào)保(bǎo)存是血小(xiǎo)板長期保存切(qiē)實可行(háng)的(dí)方法， 為(wéi)新(xīn)鮮(xiān)血小板冷凍(dòng)幹燥保(bǎo)存(cún)提供理論依(yī)據。 但對該方(fāng)法保(bǎo)存(cún)血(xiě)小(xiǎo)板(bǎn)的(dí)回(huí)收率， 穩定性(xìng)以及(jí)凝血(xiě)功能等還(huán)需(xū)做進一步研(yán)究(jiū)與改進，以達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。

文(wén)章編輯:上海拓紛機(jī)械設備有限(xiàn)公(gōng)司(sī)｛搜索公(gōng)司(sī)名即(jí)可找(zhǎo)到(dào)我(wǒ)們